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montaje (citorresin).

      Procedimiento para realizar la tinción tricrómica con fijador de Schaudinn

      1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes de fijador de Schaudinn y fijar a 50 °C durante 5 minutos o 1 hora a temperatura ambiente.

      2. Filtrar la mezcla anterior con un trozo de gasa.

      3. Centrifugar el filtrado a 800 g durante 10 minutos.

      4. Eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento con agua destilada y centrifugar a 800 g durante 10 minutos. Repetir este procedimiento mínimo tres veces o hasta obtener un sobrenadante transparente.

      

      5. Montar los portaobjetos. Escurrir bien el líquido del tubo, colocarlo boca abajo sobre un papel secante durante unos pocos segundos y agregar algunas gotas de solución de albúmina con el fin de disolver el sedimento (entre cuatro y cinco gotas, por lo general).

      6. Tomar una gota del preparado, colocarla sobre una lámina y extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

      7. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

      8. Colocar los portaobjetos horizontalmente en un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con solución saturada de alcohol yodado durante 1 minuto.

      9. Colocar los portaobjetos en alcohol al 70 % durante 1 minuto. Repetir este paso dos veces.

      10. Colocar los portaobjetos en el colorante tricrómico de 2 a 8 minutos.

      11. Colocar los portaobjetos en alcohol al 90 % acidificado de 10 a 20 segundos o hasta que haya decoloración completa.

      12. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % y enjuagar dos veces.

      13. Colocar los portaobjetos en xilol durante 1 minuto.

      14. Realizar el montaje con bálsamo o cualquier otro líquido de montaje como citorresin.

      Procedimiento para realizar la tinción tricrómica con fijador de alcohol polivinílico

      1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes del fijador PVA hasta el momento de la coloración.

      2. Tomar una gota del preparado, colocarla sobre los portaobjetos y extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

      3. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

      4. Colocar los portaobjetos en sentido horizontal en un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con alcohol yodado durante 10 minutos.

      5. Sumergir los portaobjetos en alcohol al 70 % de 3 a 5 minutos y repetir este paso dos veces.

      6. Colocar los portaobjetos en el colorante tricrómico de 6 a 8 minutos.

      7. Colocar los portaobjetos en alcohol al 90 % acidificado de 10 a 20 segundos o hasta que haya decoloración completa.

      8. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % y enjuagar.

      9. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % durante 5 minutos.

      10. Colocar los portaobjetos en xilol de 5 a 10 minutos.

      11. Realizar el montaje con bálsamo o cualquier otro líquido de montaje como citorresin.

      

      Biopsia

      El uso de exámenes endoscópicos de colon y recto permite la visualización directa de la lesión sugestiva en caso de cuadro clínico compatible con alguna forma de amibiasis intestinal (7). A su vez, este abordaje posibilita la toma de muestra de tejido de una o más lesiones, con el fin de realizar estudios histopatológicos (8,28,32). Los trofozoítos de E. histolytica se identifican a partir de la coloración del tejido con hematoxilina-eosina, pero en algunas ocasiones se requiere de la tinción tricrómica para diferenciar el trofozoíto de otras células.

      Pruebas inmunológicas

      Detección de Gal-NAc antilectina

      La detección de Gal-Nac antilectina, es una técnica que posibilita la diferenciación entre la especie E. histolytica y la E. dispar a partir de muestras de materia fecal o aspirado de líquido del absceso hepático. En la actualidad, este método solo se encuentra disponible en algunos laboratorios de referencia y no se utiliza como prueba de rutina por sus altos costos (40,41).

      Materiales y reactivos

      Para este método, se utiliza el kit comercial de Techlab® T5017/30404 (42).

      Recolección y manejo de las muestras

      La muestra debe ser fresca, recién emitida o almacenada a una temperatura entre 2 °C y 8 °C y la prueba debe llevarse a cabo en las primeras 24 horas luego de la recolección. No deben usarse especímenes fecales recogidos o almacenados en fijadores como formalina al 10 %, solución acética y formol (SAF) o solución fijadora PVA. El congelamiento y descongelamiento de la muestra, sobre todo si se hace más de una vez, puede dar como resultado la pérdida de actividad, debido a la degradación de la adhesina.

      Preparación de la muestra

      Agregar entre 0.15 g y 0.20 g de materia fecal formada, 400 µl de materia fecal líquida o 400 µl de líquido de absceso hepático a un tubo marcado y añadir 400 µl de diluyente. Finalmente, mezclar en vórtex.

      Procedimiento

      1. Seleccionar un pozo de la placa de microtitulación como control negativo; otro, como control positivo y otro para la muestra.

      

      2. Transferir 200 µl de la muestra preparada como se explicó antes, a cada uno de los pozos seleccionados para las muestras.

      3. Agregar 50 µl del conjugado a todos los pozos.

      4. Agregar 50 µl del control positivo al pozo de control positivo.

      5. Agregar 100 µl del diluyente al pozo de control negativo.

      6. Cubrir los pozos con el adhesivo disponible en el kit.

      7. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.

      8. Eliminar el contenido de los pozos.

      9. Lavar cuatro veces con solución de lavado 1X.

      10. Secar sobre papel absorbente.

      11. Agregar 100 µl del sustrato a todos los pozos.

      12. Mezclar suavemente.

      13. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

      14. Agregar 50 µl de solución de parada.

      15. Mezclar con suavidad.

      16. Leer en espectofotómetro a una longitud de onda de 450 nm.

      17. Para el cálculo de los resultados, determinar el valor de la absorbancia de los controles positivo y negativo y de las muestras. Restar el valor de absorbancia del control negativo al valor de las muestras. Se considera una muestra positiva si el resultado de la resta de absorbancias es mayor que 0.051.

      Pruebas de biología molecular

      Reacción en cadena de polimerasa

      Al igual que las pruebas para la detección de lectina Gal-NAc para la diferenciación del complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii, la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por su sigla en inglés) es una técnica que solo está disponible en algunos laboratorios de referencia en Colombia y no es utilizada como prueba de rutina para el diagnóstico de la amibiasis (34,43).

      Mantenimiento de cultivos (controles positivos, controles negativos y muestras)

      Ver mantenimiento de cultivos mixtos y axénicos en los apéndices referentes al cultivo axénico de cepa de referencia HM1:IMSS para E. histolytica (ver anexo 42)

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