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Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología. Myriam Consuelo López Páez
Читать онлайн.Название Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología
Год выпуска 0
isbn 9789587941654
Автор произведения Myriam Consuelo López Páez
Жанр Математика
Издательство Bookwire
4. Adicionar penicilina (1000 UI/ml) y estreptomicina (250 mg/ml).
5. Mantener el medio restante en refrigeración.
6. Servir 5 ml de medio en cada tubo tapa rosca.
7. Agregar las larvas a cada tubo (10 000):200, dejando 2 tubos como controles.
8. Incubar a 37 °C en atmósfera de CO2 al 10 %.
9. Verificar cada 3 días la movilidad de las larvas agitando el medio y observando en el microscopio invertido. Recoger el sobrenadante (3 ml aproximadamente) cada 7 días.
10. Agitar de nuevo el día previo a la obtención del antígeno excretorio/secretorio.
11. Reponer el volumen con medio DME fresco (3 ml).
Diagnóstico serológico para detección de anticuerpos tipo IgG anti Toxocara canis mediante ensayo inmunoenzimático
A continuación, se presentan las condiciones experimentales necesarias para llevar a cabo el diagnóstico serológico para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-Toxocara canis.
Materiales y reactivos
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: placas de poliestireno 96 pozos Immulon I, papel secante, nevera, cronómetro, micropipetas automáticas y puntas, frasco lavador, solución reguladora de revestimiento 0.05 M pH 9.6 (ver anexo 12), solución reguladora de fosfato (PBS, por su sigla en inglés) 0.15 M pH 7.4 (10X) (ver anexo 13), PBS 0.15 M pH 7.4 más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14), solución reguladora de dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15), paranitrofenilfosfato e hidróxido de sodio 3N (ver anexo 16).
Condiciones de trabajo utilizadas en Colombia Antígeno secretorio/excretorio
Preparar a partir de cultivos de larvas de Toxocara canis en medio DME (ver anexo 11). La concentración de trabajo estandarizada para ELISA es de 2.5 µg/ml de antígeno.
Suero
La dilución estandarizada de suero es de 1:800, es decir, una parte de suero por 800 partes de solución de trabajo PBS más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14). Las muestras problema y los sueros controles positivo y negativo se preparan a esta dilución.
Conjugado (anticuerpo secundario)
La solución de trabajo del conjugado corresponde a anti-IgG humana marcada con fosfatasa alcalina en una dilución de 1:1500, es decir, una parte de conjugado por 1500 partes de solución de trabajo PBS-T20 (ver anexo 14).
Sustrato
El sustrato utilizado es una solución de paranitrofenilfosfato diluido en dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15) en una proporción 1:1 w/v (1 mg de paranitrofenilfosfato diluido en 1 ml de solución reguladora de dietanolamina). La reacción se detiene con NaOH 3N (ver anexo 16).
Punto de corte
Valores de absorbancia mayores o iguales a 0.4 son considerados positivos; valores de absorbancia menores que 0.4 se consideran negativos.
Procedimiento
En la figura 1.2, se esquematiza el procedimiento ELISA indirecto para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-Toxocara canis.
Figura 1.2. Procedimiento para la realización de la prueba de ELISA indirecto.
Fuente: cortesía de Olga Lucía Morales Reyes.
1. Agregar 100 µl de la solución reguladora de revestimiento en cada pozo con el antígeno secretorio/excretorio de Toxocara canis.
2. Incubar las microplacas en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 horas.
3. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.
4. Agregar 100 µl de las diluciones de los sueros problema. Las muestras se sirven por triplicado. Dejar seis pozos de la placa libres de suero; estos pozos se utilizan como control de antígeno (tres de ellos) y control de conjugado (los tres restantes). Los seis pozos de control se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 horas.
5. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.
6. Agregar 100 µl de la dilución del conjugado en cada pozo, excepto en los tres pozos que sirven como control de antígeno; estos pozos se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a 4 °C durante 18 horas.
7. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.
8. Agregar 100 µl de la solución de sustrato en cada uno de los pozos.
9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y detener la reacción añadiendo 25 µl de NaOH 3N a cada pozo.
10. Leer la absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Confrontar las lecturas obtenidas con el valor de punto de corte establecido, revisar los resultados del control positivo y negativo y hacer el reporte correspondiente.
Los resultados se reportan como reactivo (RE) o no reactivo (NR), colocando en todos los casos el valor numérico de la absorbancia. El formato de reporte de resultados debe incluir un párrafo de interpretación que especifique el punto de corte de la técnica. Los valores de absorbancia iguales o mayores que 0.4 se consideran positivos, mientras que valores de absorbancia menores que 0.4 son negativos.
Diagnóstico de Enterobius vermicularis
Método de Graham o de la cinta engomada
Este método se fundamenta en el hecho de que la hembra adulta de Enterobius vermicularis no deposita sus huevos en el interior del intestino del humano, sino que durante la noche migra hacia las márgenes del ano y deposita los huevos en los pliegues perianales. Por esta razón, se le debe indicar al paciente que no puede bañarse antes de defecar el día de la colecta y la muestra se debe tomar en horas de la mañana. A fin de aumentar la sensibilidad de la técnica, se pueden tomar tres muestras en días diferentes de la semana (24).
Con esta técnica se pueden observar huevos de otros parásitos como Taenia spp., Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e Hymenolepis nana, entre otros.
Materiales y reactivos para la obtención y la lectura de la muestra
Los materiales y reactivos necesarios para este método son: guantes de látex, cinta adhesiva transparente, bajalenguas, portaobjetos y microscopio.
Procedimiento
En la figura 1.3, se esquematiza el procedimiento para la obtención de la muestra del método de Graham o cinta engomada.
Figura 1.3. Procedimiento para la toma de muestra del método de Graham.
Fuente: cortesía de Juan Edwin Villalobos Ospina.
1. Colocar la cinta transparente, con la parte adherente hacia fuera, sobre un extremo del bajalenguas. La cinta se sujeta con ayuda de los dedos pulgar e índice. El tamaño de la cinta debe ser de aproximadamente 13 cm de largo por 2 cm de ancho.
2. Hacer varias aplicaciones en la superficie de la región perianal del paciente.
3. Separar con cuidado la cinta del bajalenguas y colocarla sobre un portaobjetos, evitando la formación de burbujas.
4. Observar al microscopio con objetivo de 10X.
INFECCIONES POR PROTOZOOS INTESTINALES
Según