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Fisher Scientific, Germering, Deutschland

3.1 Einführung

      Mit der zunehmenden Verbreitung von massenspektrometrischen Detektionssystemen jenseits der innovationstragenden Forschungslabore hinein in die Routineanalytik von Qualitätskontrolllaboratorien steigt auch der Bedarf an neu entwickelten HPLC-MS-Methoden. Heutige Massenspektrometer für den Routinebereich haben erhebliche Fortschritte beim Bedienkomfort gemacht und den Ruf einer Diva für Experten hinter sich gelassen, was ihre Benutzung auch durch weniger versierte Anwender:innen deutlich vereinfacht. Daneben existiert nach wie vor das zum Teil seit Jahrzehnten ehern festgeschriebene Regelwerk der verschiedenen Arzneimittelbücher und Pharmakopöen, die bis heute HPLC-Methoden beschreiben, welche mit den Anforderungen der Massenspektrometrie nicht kompatibel sind. Im Laboralltag stellen sich daher häufig zwei unterschiedliche Aufgaben: Neben die Entwicklung und Validierung neuer HPLC-MS-Methoden tritt oft die Herausforderung, eine etablierte Methode MS-gängig zu machen. Beide Aspekte sollen hinsichtlich ihrer Vorgehensweise und Optimierung diskutiert werden. Welche HPLC-MS-Systeme und -Methoden sich bevorzugt für welches Ziel einer Analytik eignen und wie man sie bestmöglich einsetzt, geht über den Rahmen der Optimierungsbetrachtung hinaus und wird in weiterführender Literatur behandelt [1]. Bei der Betrachtung der MS- relevanten Aspekte beschränkt sich dieses Kapitel auf Elektrosprayionisierung (ESI) und Chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck (APCI) als die häufigsten Ionisierungsverfahren der HPLC-MS-Kopplung.

3.2 Methodenneuentwicklung für HPLC-MS-Trennungen

Die Herangehensweise bei der Entwicklung einer neuen LC-MS-Trennmethode unterscheidet sich nicht grundlegend von derjenigen für klassische LC-Methoden. Allerdings gilt es, eine UHPLC-Trennung unter Berücksichtigung der besonderen Anforderungen zu entwickeln, die durch die Massenspektrometrie diktiert werden. Parallel dazu wird das Massenspektrometer in seinen Einstellparametern zur Io- nenquelle, der Ionentransferoptik sowie dem jeweiligen Massenanalysator auf die zu bestimmenden Analyten optimiert. Diese beiden Schritte geschehen in der Regel zunächst getrennt voneinander. Anschließend koppelt man die UHPLC mit der Massenspektrometrie und bestimmt den Einfluss von Matrixeffekten, bevor man abschließend die gekoppelte UHPLC-MS-Methode einer Tauglichkeitsprüfung bzw. Validierung unterzieht.

      Daraus ergibt sich folgende Abfolge:

      1 1. Ausarbeitung der LC-Trennung (offline)

      2 2. Optimierung der massenspektrometrischen Parameter (offline)

      3 3. Verifizierung der massenspektrometrischen Einstellungen und Bestimmung von Matrixeffekten

      4 4. Finale Kopplung mit anschließender Methodenvalidierung

      Auf die einzelnen Teilschritte soll im Folgenden näher eingegangen werden. Wie diese ausführliche Optimierung bei Bedarf kombiniert und automatisiert werden kann, wird im Abschn. 3.2.5 kurz umrissen.

      3.2.1 Optimierung der LC-Trennung

      Auf die Optimierung einer HPLC-Trennung im Allgemeinen wird in diesem Buch bereits an verschiedenen Stellen eingegangen (siehe Kap. 9 und 12), daher beschränkt sich dieses Kapitel auf die Aspekte, die in der LC-MS-Analytik besonders zu beachten sind oder eine andere Gewichtung erfahren müssen.

3.2.1.1 Optimierungsziel Empfindlichkeit/Nachweisgrenze – welche Trennsäule nehmen?

Ein wesentlicher Unterschied in der LC-MS-Analytik im Vergleich zu konventionellen HPLC-Methoden liegt in der maximalen Flussrate, die zur Trennung verwendet werden kann. Dies liegt in der Ionenquelle des Massenspektrometers begründet, die pro Zeit nur eine begrenzte Menge an mobiler Phase in die Gasphase überführen und quantitativ von den Analytmolekülen entfernen und von dem Innenleben des Massenspektrometers fernhalten kann. Elektrosprayionisation (ESI), die in über 80 % aller publizierten Online-LC-MS-Kopplungen eingesetzt wird (gefolgt von AP-CI mit über 16 %), lässt sich mit pneumatischer Unterstützung eines Vernebelungsgases im Flussbereich von etwa 50–300 μl/min bei bestmöglicher Empfindlichkeit betreiben. Alle kommerziellen ESI-Quellen (mit Ausnahme von Nanosprayquellen) verkraften auch deutlich höhere Flussraten von bis zu 1 ml/min und darüber, wobei zahlreiche Beispiele in der Literatur belegen, dass die Empfindlichkeit von ESI-Methoden erst dann zu leiden beginnt, wenn es nicht mehr gelingt, die Menge an mobiler Phase effektiv zu entfernen, es mithin „die eine“ magische Obergrenze der Flussrate in der LC-MS-Analytik nicht gibt. Viele LC-MS-Analytiker:innen setzen trotzdem lieber auf eine konservativ niedrige LC-Flussrate bis maximal 300–500 μl/min, statt sich an der optimalen Lineargeschwindigkeit für die gegebenen LC-Trägerpartikel, sprich, dem Minimum der van-Deemter-Kurve, zu orientieren. Um die LC-Trennung dennoch möglichst effizient zu betreiben, überschreiten die Säuleninnendurchmesser für LC-MS-Applikationen deshalb 2,1 mm nicht. Eine UHPLC-Säule dieses Durchmessers und eines mittleren Teilchendurchmessers des Phasenmaterials d_p von 2 μm hat ihre optimale Lineargeschwindigkeit in grober Näherung bei rund 5,5 mm/s, was bei einer 2,1 mm-ID-Säule bereits einer Flussrate von etwa 1,1 ml/min entspricht. In der Praxis reduzieren viele LC-MS-Anwender:innen diese Flussrate, um die Trocknungsleistung der Ionenquelle nicht zu überfordern, auch wenn die LC-Trennung dann bereits mit tendenziell zu hohem Einfluss der Longitudinaldiffusion (B-Term) gefahren wird. Eine Reduktion des Säuleninnendurchmessers auf 1 mm wird aus mehreren Gründen kontrovers diskutiert, auch wenn sich viele Anwender:innen von dem kleineren Innendurchmesser eine niedrigere Nachweisgrenze versprechen, da die Probenmoleküle in einem kleineren Peakvolumen verdünnt würden. Eine ausführlichere Erörterung dieser Problematik kann der Literatur entnommen werden [2]. Kurz gesagt kann mit konzentrationsempfindlichen Detektoren (insbesondere ESI wird als bevorzugt konzentrationsempfindlicher Prozess beschrieben) bei Anwendung der Skalierungsgesetze der Chromatographie auf einer 2,1 mm-ID-Trennsäule dieselbe Nachweisgrenze erreicht werden wie auf einer 1 mm-ID-Trennsäule, sofern man das 4,4-fache Probenvolumen injiziert. Technisch sind Trennungen auf 2,1 mm-ID-Säulen allerdings robuster als jene auf 1 mm-ID-Säulen, was sowohl am verwendeten Säulenmaterial als auch an der begrenzten Eignung von UHPLC-Systemen für sehr niedrige Flussraten von weniger als 50 μl/min liegt. Damit bleiben für die Verwendung von 1 mm-ID-Trennsäulen nur zwei Gründe übrig: Man ist entweder derart limitiert in der Probenmenge, dass Injektionsvolumina von 4–5 μl pro Messung zu viel Probenmenge verbrauchen, oder die MS-Ionenquelle beschränkt den Anwender tatsächlich auf Flussraten von etwa 100 μl/min oder weniger. Letzteres kommt in der Praxis allerdings selten vor. Kommerzielle ESI-Quellen mit pneumatischer Vernebelung kommen in der Regel mit Flussraten bis zu 600–700 μl/min ohne Einbußen in der Empfindlichkeit gut zurecht. APCI ist mit höheren Flussraten prinzipbedingt noch besser kompatibel, da es einer Mindestflussrate von etwa 200 μl/min bedarf, um ausreichend Eluent zur Bildung des Reaktantgases in der APCI-Quelle zu verdampfen.

      Empfehlungen

       • Beim korrekten Skalieren von LC-Trennungen über verschiedene Säulendurchmesser entsteht bei konzentrationsempfindlichen Detektoren wie ESI-MS kein nennenswerter Empfindlichkeitsgewinn.

       • Für die meisten LC-MS-Trennungen sind Säuleninnendurchmesser von 2,1 mm ausreichend; selbst UHPLC-Phasenmaterialien von dp ≤ 2 μm können in aller Regel noch an oder nahe ihrem Effizienzoptimum betrieben werden.

       • Innendurchmesser von unter 2,1 mm sind nur in zwei Fällen unersetzlich, bei erheblich limitiertem Probenvolumen und/oder drastisch reduzierten Flussraten von unter 100µl/min. wegen technischer Randbedingungen wie dem Design der MS-Ionenquelle.

3.2.1.2 Optimierungsziel Auflösung gegenüber Probendurchsatz

      Wie bei der Entwicklung und Optimierung einer konventionellen HPLC-Methode auch, stellt sich bei LC-MS-Methoden eingangs die Frage nach dem Ziel, das die Trennmethode mit MS-Detektion

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